Инактивация ферментов под влиянием кислорода. Пероксидация липидов

Ферментативный гидролиз крахмала протекает под влиянием ферментов амилаз, которые содержатся в слюне, соке поджелудочной железы, крови, печени, мозге. Источниками амилаз в промышленности служат проросшие зерна злаков (солод) и культуры плесневых грибов.

Известны а- и -амилазы, которые несколько различаются по характеру действия. Под влиянием а-амилазы процесс гидролитического расщепления крахмала задерживается главным образом на стадии декстринов, а мальтозы образуется немного, тогда как под действием Р-амилазы расщепление идет в сторону преимущественного

образования мальтозы. Последовательно этот процесс можно представить следующим образом.

Мальтоза под действием фермента мальтазы (а-глю-козидазы) распадается на две молекулы a-D-глюкозы. Встречается также фермент глюкоамилаза, катализирующий распад крахмала до глюкозы.

Ход процесса гидролитического расщепления крахмала можно проследить с помощью реакций Троммера, Бенедикта или Ниландера (см. раздел VII), характеризующих восстанавливающие свойства углеводов.

При ферментативном гидролизе крахмала увеличивается количество свободных гликозидных гидроксилов, обусловливающих восстанавливающие свойства, и поэтому мальтоза и глюкоза способны восстанавливать окись меди до закиси, гидрат окиси висмута или окись серебра до металлов.

Реактивы: а) слюна. Свежую слюну разводят в 10 раз дистиллированной водой: б) крахмал, -ный раствор; в) раствор иода в иодистом калии (раствор Люголя): в нескольких миллилитрах воды растворяют 1 г иодистого калия, в концентрированном растворе соли растворяют 1 г иода и доливают водой до 300 мл; г) едкий натр, 5%-ный раствор; д) сернокислая медь -ный раствор.

В две пробирки наливают по -ного раствора крахмала, в одну из них добавляют 1 мл разведенной слюны (1: 10), в другую - 1 мл воды и ставят на 10 мин.

в водяную баню, нагретую до 37-38° (внимательно следят за температурой, не допуская ее повышения), или, еще лучше, в ультратермостат, после чего охлаждают пробирки под краном. Проделывают реакции Троммера и с иодом, для чего содержимое каждой пробирки делят пополам.

Инактивация ферментов высокой температурой.

Являясь белковыми веществами, ферменты весьма чувствительны к температуре, при которой протекает реакция. Температурный оптимум действия ферментов теплокровных животных составляет 37-38° С. При небольшом повышении температуры (например, 40-45° С) скорость ферментативных реакций вначале повышается, но уже при дальнейшем нагревании (выше 50° С) падает, а при 70-80° утрачивается. Кипячение влечет за собой полную потерю каталитической активности ферментов вследствие денатурации их белковой части (апоферментов). При температурах ниже нуля скорость ферментативных реакций значительно понижается, но сами ферменты не разрушаются и при осторожном оттаивании восстанавливают свою активность.

Реактивы: а) слюна, разведенная в 5 раз дистиллированной водой; б) крахмал, 1%-ный раствор; в) раствор иода в иодистом калии (см. предыдущую работу); г) реактивы для реакции Троммера (см. предыдущую работу).

В две пробирки наливают по 1 мл разведенной слюны. Содержимое одной из них нагревают до кипения и кипятят 2-3 мин. Затем в обе пробирки добавляют по 1 мл раствора крахмала и ставят на 10 мин. в водяную баню, нагретую до 38° С, после чего проделывают реакции Троммера и с иодом. Убеждаются, что в пробирке, в которой фермент был инактивирован кипячением, расщепления крахмала не произошло.

Специфичность действия ферментов.

Это одно из важнейших свойств ферментов. Каждый фермент воздействует лишь на определенное вещество или группу веществ, близких по своей структуре. Различают следующие виды специфичности: а) абсолютную, когда ферменты катализируют лишь одну реакцию превращения какого-либо вещества. Например, уреаза (карбамид - амидогидролаза) катализирует только реакцию гидролитического расщепления мочевины до аммиака и двуокиси

углерода; б) групповую, когда ферментом катализируются реакции превращения близких по своей структуре веществ, построенных по одному типу. Так, сахараза (Р-фруктофуранозидаза) катализирует реакцию гидролитического расщепления сахарозы с освобождением молекул глюкозы и фруктозы, но тот же фермент катализирует также реакцию частичного гидролиза трисахарида рафинозы (а-галактозидо-а-глюкозидо-р-фруктозида), при которой освобождается лишь молекула фруктозы, а связь между галактозой и глюкозой остается ненарушенной; в) стереохимическую, которая проявляется в том, что фермент катализирует реакцию расщепления или синтеза только одного из стереоизомеров, не воздействуя на другой. Окисление L-молочной кислоты до пировиноградной катализируется ферментом лактатдегидрогеназой, тогда как тот же процесс D-молочной кислоты катализируется другим ферментом - -лактатде-гидрогеназой.

Реактивы: а) слюна, разведенная в 10 раз дистиллированной водой; б) сахароза, 1%-ный раствор; в) крахмал, 1%-ный раствор; г) реактивы для реакции Троммера.

В две пробирки наливают по 1 мл разведенной слюны, затем в одну из них добавляют 1 мл раствора сахарозы, а в другую - столько же раствора крахмала. Обе пробирки прогревают 10 мин. в водяной бане при температуре 38° С, после чего охлаждают и с содержимым каждой из них проделывают реакцию Троммера. Убеждаются, что амилаза катализировала лишь процесс гидролитического расщепления крахмала и не оказала действия на сахарозу.

Влияние pH среды на активность амилазы слюны.

Каждый фермент проявляет максимум своего каталитического действия при строго определенном pH среды. Наивысшую активность многие ферменты проявляют в изоэлектрической точке.

Оптимальное значение pH для пепсина составляет 1,5-2,0, амилазы слюны -6,8-7,0, трипсина - 7,8, липазы поджелудочной железы - 7,0-7,8. Было, однако, показано, что ферменты, катализирующие одни и те же реакции, но выделенные из различных субстратов, проявляют оптимум действия при неодинаковых значениях pH. Так, оптимум действия кишечной сахаразы наблюдается

при pH 6,2, а сахаразы, выделенной из дрожжей, - при pH 4,6-5,0. Оптимум pH амилазы слюны составляет 6,8-7,0, а амилаза солода проявляет максимум каталитической активности при pH 4,4-4,5.

Реактивы: а) слюна, разведенная дистиллированной водой в 100 раз; б) крахмал, 0,5%-ный раствор; в) лимонная кислота, 0,1 М раствор (19,212 г кислоты в 1 л); г) фосфорнокислый натрий двузамещенный М раствор (содержит 36,62 г соли в 1 л); д) раствор Люголя (раствор иода в иодистом калии); е) хлористый натрий, 1%-ный раствор.

В 7 однотипных пробирок пипетками наливают растворы лимонной кислоты и фосфорнокислого натрия в количествах, указанных в табл. 4, получая таким образом буферные смеси со значениями pH от 5,6 до 8,0. В каждую пробирку добавляют по 10 капель 1 %-ного раствора хлористого натрия, 0,5%-ного раствора крахмала, разведенной в 100 раз слюны и перемешивают.

Табл. 4. Фосфатно-цитратные буферные смеси

Пробирки ставят на 10 мин. в водяную баню при температуре 38° С, после чего быстро охлаждают, добавляют во все пробирки по 1 капле раствора Люголя, перемешивают и наблюдают окраску. Устанавливают, при каком pH произошло наиболее полное расщепление крахмала (желтая или буровато-желтая окраска с иодом). Реакция весьма специфична и показательна.

Как видно из рис. 46, для большинства систем можно выделить период времени, в течение которого интенсивность отказов постоянна:

λ(t) = λ = const.

Если интенсивность отказов в данном промежутке времени постоянна и не является функцией времени, то согласно уравнению (3.64) функция надежности имеет вид

P(t) = e -λt . (3.70)

Этот экспоненциальный закон весьма широко применяется в теории надежности.

Очевидно, что опасность отказа λ в этом случае имеет смысл константы скорости инактивации фермента k и связана с определенным физико-химическим процессом в активном центре фермента, приводящим к потере каталитической активности.

Таким образом, показатель экспоненты в уравнении (3.70) допускает два толкования. С точки зрения химической кинетики - это константа скорости мономолекулярной реакции превращения фермента Е в неактивную форму Е i , в терминах теории надежности - интенсивность отказов. Очевидно, что по физическому смыслу эти понятия эквивалентны и представляют собой частоту элементарных актов инактивации молекул фермента.

Среднестатистическое время работы всех молекул катализатора, инактивирующегося по экспоненциальному закону, равно

Т 0 = 1/k. (3.71)

Применение теории надежности позволяет очень просто сделать ряд важных качественных выводов о кинетических закономерностях инактивации сложных полиферментных систем. В работах рассмотрены кинетические закономерности инактивации полиферментных систем в предположении, что каждый из ферментов инактивируется по экспоненциальному закону.

Рассмотрим полиферментную систему с участием n ферментов, инактивирующихся по экспоненциальному закону. Для полиферментных систем, осуществляющих превращение исходного субстрата до конечного продукта реакции, инактивация любого из ферментов ведет к потере каталитической функции всей системы. Если ферменты инактивируются независимо друг от друга, вероятность безотказной работы всей системы в целом будет равна произведению вероятностей безотказной работы каждого фермента цепи в отдельности. Функция надежности имеет вид

P(t) = P 1 (t) ... P i ... P n (t).(3.72)

Если инактивация каждого фермента происходит с интенсивностью

P i (t) = e -λ i t , (3.73)

подстановка уравнения (3.73) в уравнение (3.72) приводит к функции

Среднее время работы будет иметь вид

(3.75)

Наибольший вклад в сумму (знаменатель этого уравнения) вносят наиболее быстрые кинетические процессы инактивации, и, таким образом, среднее время безотказной работы полиферментных систем определяется устойчивостью наиболее лабильных белков. Если в цепи ферментов есть лабильный белок, инактивирующийся быстрее, чем остальные белки полиферментной системы, инактивация именно этого фермента и будет проявляться в кинетике инактивации всей системы.

Рассмотрим систему параллельно работающих ферментов, катализирующих одну и ту же реакцию и инактивирующихся с различными скоростями. Для случая произвольного числа фракций фермента, различающихся активностью и стабильностью, анализ соответствующей функции надежности приводит к уравнению

(3.76)

где a j , λ j - начальные активности и константы скорости инактивации каждой фракции фермента соответственно; А 0 - сумма начальных активностей или регистрируемая каталитическая активность системы в начальный момент времени.

Важно отметить, что среднее время безотказной работы системы параллельно работающих ферментов определяется наиболее активной (наибольшей a j) или наиболее стабильной (наименьшей λ j) фракцией фермента. Это отличает данную систему от системы последовательно работающих катализаторов, в которой надежность определяется наиболее лабильным белком.

Ферменты, объединенные в системы и осуществляющие цепь последовательных превращений субстратов, в общем случае обладают различной устойчивостью к инактивирующим воздействиям. В силу этого в процессе инактивации полиферментной системы может происходить смена лимитирующей стадии. Представим себе, что наиболее медленно работающий фермент, скорость реакции с которым определяет активность всей системы в целом, достаточно устойчив. При этом, если один из ферментов цепи быстро теряет свою активность, возникает ситуация, когда скорость процесса определяется активностью именно этого, наиболее лабильного фермента. Таким образом, по мере инактивации системы происходит смена лимитирующей стадии. Это должно накладывать отпечаток на кинетику инактивации.

Рассмотрим линейную полиферментную цепь. Согласно анализу в определенных условиях стационарная скорость процесса с участием n ферментов описывается уравнением

(3.77)

где [S] 0 - начальная концентрация первого субстрата; υ i , K i - максимальная скорость и константа Михаэлиса каждого участка цепи. Рассмотрим случай, когда в цепи есть два фермента, обладающих максимальными и соизмеримыми кинетическими параметрами K i /υ i . Если величины параметра K i /υ i для остальных ферментов цепи существенно меньше величины этого параметра для двух ферментов, уравнение стационарной скорости будет иметь вид

(3.78)

где индексы i и j характеризуют параметры каждого фермента.

Предположим, что инактивация обоих ферментов происходит по экспоненциальному закону, т. е. каждый фермент инактивируется с постоянной во времени интенсивностью отказов λ i и λ j . Функция надежности имеет вид

(3.79)

где A i = k кат, i 0 .

Кинетическое поведение системы в процессе инактивации определяется отношением кинетических параметров

(3.80)

и разностью интенсивностей отказов двух ферментов. Рассмотрим три наиболее важных частных случая:

1. Частоты отказов обоих ферментов цепи равны между собой

λ i = λ j (3.81)

Функция надежности имеет вид

P(t) = e -λ i t .(3.82)

Кинетика процесса определяется интенсивностью отказов любого из ферментов вне зависимости от того, какой фермент лимитирует скорость полиферментной реакции. Это самый простой случай.

2. Процесс лимитируется j ферментом цепи, который инактивируется существенно быстрее остальных. Это соответствует условиям

α = (A i /K i)/(A j /K j) >> 1; λ i

Функция надежности дается уравнением

P(t) = e -λ j t . (3.84)

Кинетика инактивации системы имеет экспоненциальный характер. Надежность и среднее время работы системы определяется интенсивностью отказов лимитирующего скорость фермента.

Скорость ферментативной реакции, иными словами, активность фермента определяется также присутствием в среде активаторов и ингибиторов: первые повышают скорость реакции и иногда модифицируют ее, вторые - тормозят реакцию. Среди химических соединений, оказывающих влияние на активность ферментов, встречаются разнообразные вещества. Так, НС1 активирует действие пепсина, желчные кислоты - панкреатической липазы; некоторые тканевые ферменты (оксидоредуктазы, катепсины, аргиназа), растительная протеиназа папаин и др. в значительной степени активируются соединениями, содержащими свободные SH-группы (глутатион, цистеин), а некоторые также витамином С. Особенно часто в качестве активаторов служат (выступают) ионы двухвалентных и иногда одновалентных металлов. Многие ферменты вообще не активны в отсутствие металлов. Так, при удалении цинка угольная ангидраза практически лишена ферментативной активности; более того при действии этого фермента цинк не может быть заменен никаким другим металлом. Известны ферменты, действие которых активируется рядом металлов, в частности, енолаза (см. Углеводный обмен) активируется Mg 2+ , Mn 2+ , К + . В табл. 18 приведены примеры участия металлов в действии некоторых ферментов.

Таблица 18. Металлы в активировании некоторых ферментов 1 (1 Обычно трудно провести границу между металлоферментами (металл связан комплексно н незаменим) и ферментами, активируемыми металлами (последние лишь ускоряют реакцию и легко диссоциируют). )
Фермент	Металл	Фермент	Металл
Цитохромы	Fe	Амилаза	Са
Каталаза	Fe	Липаза	Са
Пероксидаза	Fe	Карбоангидраза	Zn
Триптофаноксидаза	Fe	Лактатдегидрогеназа	Zn
Гомогентизиказа	Fe	Уриказа	Zn
Аскорбатоксидаза	Си	Карбоксипептидаза	Zn
Тирозиназа	Си	Пептидазы	Mg
Фенолоксидаза	Си	Фосфатазы	Mg
Ксантиноксидаза	Мо	Фосфоглюкокиназа	Mg
Нитратредуктаза	Мо	Аргиназа	Mn
Альдегидоксидаза	Мо	Фосфоглюкомутаза	Mn
Пептидазы	Со	Холинэстераза	Mn

Относительно роли металлов в активирующем действии ферментов имеющиеся данные свидетельствуют о том, что в ряде случаев ионы металлов (Со 2+ , Mg 2+ , Zn 2+ , Fe 2+) выполняют функции простетических групп ферментов. В других случаях они способствуют присоединению субстрата к активному центру и образованию фермент-субстратного комплекса. Например, ионы Mg 2+ через отрицательно заряженную фосфатную группу обеспечивают присоединение монофосфорных эфиров органических веществ к активному центру фосфатаз, катализирующих гидролиз этих соединений. В ряде случаев металл соединяется с субстратом, образуя истинный субстрат, на который действует фермент. В частности, ионы Mg 2+ активируют креатинфосфокиназу благодаря образованию истинного субстрата и магниевой соли АТФ. Наконец, имеются экспериментальные доказательства прямого участия металлов (например, ионов Са 2+ в молекуле амилазы слюны) в формировании и стабилизации активного центра и всей третичной структуры молекулы фермента. Следует отметить также нередкую роль мeталлов в качестве аллостерических модуляторов (см. рис. 59). Взаимодействуя с аллостерическим центром, подобный металл (модулятор) способствует образованию наиболее выгодной пространственной конфигурации фермента и активного фермент-субстратного комплекса.

Анионы при физиологических концентрациях обычно неэффективны или оказывают небольшое активирующее влияние на ферменты. Исключение составляют пепсин, некоторые оксидоредуктазы, активируемые анионами, а также слюнная амилаза, катализирующая гидролиз крахмала, активность которой повышается ионами хлора, и аденилатциклаза, которая активируется анионами галогенов.

Ингибиторами принято называть вещества, вызывающие частичное или полное торможение реакций, катализируемых ферментами. Поскольку ферменты являются белками, любые агенты, вызывающие денатурацию белка (нагревание, кислоты, щелочи, соли тяжелых металлов), приводят к инактивации фермента. Однако подобное инактивирование относительно неспецифично. Оно не связано с механизмом действия ферментов. Гораздо большую группу составляют так называемые специфические ингибиторы, которые оказывают свое действие на один какой-либо фермент или на группу родственных ферментов. Исследование этих ингибиторов имеет важное значение по ряду причин.

Во-первых, ингибиторы могут дать ценную информацию о природе активного центра фермента, а также его функциональных групп и химических связей, обеспечивающих образование фермент-субстратного комплекса. Известны вещества, специфически связывающие ту или иную группу в молекуле фермента, выключая ее из сферы химической реакции. В частности, йодацетат IСН 2 -СООН, его амид и этиловый эфир, парахлормеркурибензоат ClHg - С 6 Н 4 -СООН и другие реагенты сравнительно легко вступают в химическую связь с некоторыми SH-группами ферментов. Если такие группы существенны для акта катализа, то добавление подобных ингибиторов приводит к полной потере активности фермента:

R-SH + IСН 2 -СООН --> HI + R-S-СН 2 -СООН

Ряд других ферментов (холинэстераза, трипсин и химотрипсин) сильно тормозится некоторыми фосфорорганическими соединениями, в частности диизопропилфторфосфатом (ДФФ), вследствие блокирования ключевой гидроксильной группы сери-на в активном центре (см. выше).

Во-вторых, ингибиторы нашли широкое применение в энзимологии при исследовании природы множественных форм ферментов и изоферментов, отличающихся не столько по электрофоретической подвижности, сколько по различию реакций на один и тот же ингибитор.

При помощи ингибиторов, избирательно выключающих отдельные стадии многоступенчатого метаболического процесса, могут быть точно установлены последовательность химических реакций и природа участвующих ферментов. В частности, этим путем при применении йодацетата, фторида и других ингибиторов был расшифрован гликолитический путь окислительно-восстановительных превращений глюкозы до молочной кислоты в мышечной ткани (см. Обмен углеводов), насчитывающий 11 стадий с участием 11 ферментов и 10 промежуточных метаболитов.

На ингибировании ферментов основан механизм действия многих токсинов и ядов на организм. Так, известно, что при отравлениях синильной кислотой смерть наступает вследствие полного торможения дыхательных ферментов (цитохромоксидазы), в особенности клеток мозга. Токсическое влияние на организм человека и животных некоторых инсектицидов обусловлено торможением активности холинэстеразы - фермента, играющего первостепенную роль в деятельности нервной системы.

Рациональная химиотерапия - осознанное применение лекарственных препаратов в медицине, должна опираться на точное знание механизма их действия, на биосинтез ферментов или работу их в организме. Иногда метод лечения болезней человека включает применение избирательных ингибиторов. Так, ингибитор трипсина, химотрипсина и калликреина трасилол широко используется при лечении острого панкреатита. Избирательное ингибиторное действие на ферменты некоторых природных и синтетических соединений (так называемых антиметаболитов) в настоящее время служит основой для разработки эффективных методов синтеза химиотерапевтических препаратов. На этом пути открываются широкие возможности регуляции как синтеза ферментов, так и интенсивности метаболизма.

Типы ингибирования. Несмотря на то что механизм действия большинства ингибиторов не выяснен, обычно различают обратимое и необратимое ингибирование. Если молекула ингибитора вызывает стойкие изменения или модификацию функциональных групп фермента, то такой тип ингибирования называется необратимым. Чаще, однако, имеет место обратимое ингибирование, поддающееся количественному изучению на основе уравнения Михаэлиса - Ментен. Обратимое ингибирование в свою очередь разделяют на конкурентное и неконкурентное, в зависимости от того, удается или не удается преодолеть торможение ферментативной реакции путем увеличения концентрации субстрата. Во втором случае повышение концентрации субстрата не изменяет степень ингибирования фермента.

Конкурентное ингибирование может быть вызвано веществами, имеющими структуру, похожую на субстрат, но немного отличающуюся от структуры истинного субстрата. Классическим примером подобного типа ингибирования является торможение активности сукцинатдегидрогеназы малоновой кислотой. Этот фермент катализирует окисление путем дегидрирования янтарной кислоты в фумаровую в соответствии со схемой:

Если в среду добавить малоновую кислоту (ингибитор), то в силу структурного сходства ее с истинным субстратом янтарной кислотой (наличие двух таких же ионизированных карбоксильных групп) она будет реагировать с активным центром с образованием фермент-ингибиторного комплекса (см. схему), однако при этом перенос водорода от малоната не происходит. Так как структуры субстрата - янтарной кислоты и ингибитора - малоната все же несколько отличаются, они конкурируют за связывание с активным центром, и степень торможения будет определяться соотношением концентраций малоната и сукцината, а не абсолютной концентрацией ингибитора. Этот тип ингибирования иногда называют ингибированием по типу метаболического антагонизма (рис. 56).

В общей форме реакция взаимодействия ингибитора с ферментом может быть представлена следующим уравнением:

Образовавшийся комплекс, называемый фермент-ингибиторным комплексом (EI), в отличие от ES не распадается с образованием продуктов реакции. Константу диссоциации EI-комплекса или ингибиторную константу (K 1) можно, следуя теории Михаэлиса - Ментен, определить как отношение констант обратной и прямой реакций:

т. е. ингибиторная константа прямо пропорциональна произведению концентрации фермента и ингибитора и обратно пропорциональна концентрации ЕI-комплекса.

Метод конкурентного торможения нашел широкое применение в медицинской практике. Известно, например, что для лечения некоторых инфекционных заболеваний, вызываемых бактериями, применяют сульфаниламидные препараты. Оказалось, что эти препараты имеют структурное сходство с парааминобензойной кислотой, которую бактериальная клетка использует для синтеза фолиевой кислоты, являющейся составной частью ферментов бактерий. Благодаря этому структурному сходству сульфаниламид, например, блокирует действие фермента путем вытеснения парааминобензойной кислоты из комплекса с ферментом, синтезирующим фолиевую кислоту, что ведет к торможению роста бактерий.

Некоторые аналоги витамина В 6 и фолиевой кислоты, в частности дезоксипиридоксин и аминоптерин (см. Витамины), действуют как конкурентные, так называемые коферментные ингибиторы (или антивитамины), тормозящие многие биохимические процессы в организме.

Неконкурентное ингибирование вызывается веществами, не имеющими структурного сходства с субстратами и часто связывающимися не с активным центром, а в другом месте молекулы фермента. Степень торможения во многих случаях определяется продолжительностью действия ингибитора на фермент. При данном типе ингибирования благодаря образованию стабильной ковалентной связи фермент часто подвергается полной инактивации, и тогда торможение становится необратимым. Примерами неконкурентного ингибирования (инактивации) является действие йодацетата, диизопропилфторфосфата, а также диэтил-n-нитрофенилфосфата и синильной кислоты, заключающееся в связывании и выключении функциональных групп или ионов металлов в молекуле фермента.

Для выяснения вопроса о типе ингибирования пользуются уравнением Михаэлиса - Ментен, графиком Лайнуивера - Бэрка и другими более усовершенствованными уравнениями, например уравнением Эди - Хофсти:

v = - К m (0/[S]) + V mах

и соответствующими графиками в прямолинейных координатах. В приведенных ниже графиках, построенных в координатах v и [S], а также в координатах 1/v и 1/[S], V - максимальная скорость реакции, V 1 - максимальная скорость в присутствии ингибитора, К 1 - ингибиторная константа; все остальные символы были представлены выше.

Видно, что при конкурентном типе ингибирования (рис. 57) ингибитор увеличивает значение К m (на величину, равную разнице в длине отрезков, отсекаемых от оси абсцисс), не оказывая влияния на максимальную скорость. Это означает, что при достаточно высокой концентрации субстрата [S] ингибитор вытесняется молекулами субстрата из комплекса EI. При неконкурентном ингибировании (рис. 58) ингибитор снижает величину максимальной скорости. Если при этом величина К m не уменьшается, то говорят о полностью неконкурентном ингибировании. Подобный тип ингибирования имеет место при образовании неактивных, труднодиссоциирующих комплексов EI и (или) EIS. Часто, однако, имеет место смешанный тип ингибирования (иногда называемый частично неконкурентным типом), при котором снижение V mах сочетается с увеличением К m . Это означает, что комплекс EI сохраняет частичную активность, т. е. способность к образованию промежуточного тройного комплекса EIS, в котором субстрат подвергается замедленному каталитическому превращению. В редких случаях степень торможения активности фермента может увеличиваться с повышением концентрации субстрата; для этого типа торможения был предложен довольно неточный термин бесконкурентный (от англ. uncompetitive). Один из механизмов такого торможения обусловлен возможностью соединения ингибитора с комплексом ES с образованием неактивного или медленно реагирующего тройного комплекса ESI.

Таким образом, при графическом анализе скоростей ферментативных реакций как функции концентраций субстрата может быть получена ценная информация по кинетике ферментативных реакций, освещающая возможный механизм ферментативного катализа.

Регуляция активности ферментов

Выше было указано, что одним из уникальных свойств живых организмов является удивительная способность к сбалансированности катаболических (биодеградативных) и анаболических (биосинтетических) процессов. Хотя в клетках одновременно совершаются процессы синтеза, распада и взаимопревращения сотен и тысяч разнообразных веществ, имеется множество регуляторных механизмов, обеспечивающих постоянство внутренней среды организма. Некоторые из этих регуляторных механизмов, среди которых важная роль принадлежит механизмам регуляции активности ферментов, будут рассмотрены ниже.

Влияние закона действия масс. В катализируемой ферментом обратимой химической реакции, например A+B C+D, концентрация компонентов реакции и соответственно направление реакции будут регулироваться влиянием закона действия масс. Оно, в частности, может быть показано в обратимой реакции трансаминирования, катализируемой аланинаминотрансферазой:

Аланин + α-Кетоглутарат Пируват + Глутамат.

Этот тип регуляции играет, очевидно, лишь ограниченную роль, поскольку в реальных условиях реакция обычно протекает в одном направлении, так как образовавшиеся продукты могут оказаться субстратами для действия других ферментов и выводиться из сферы реакции; в этих случаях устанавливается скорее устойчивое (стационарное) состояние, чем истинное равновесие.

Изменение количества фермента. У бактерий хорошо изучен феномен индуцированного синтеза ферментов при выращивании их на среде, где единственным источником углерода и энергии служит тот или иной углевод, допустим, глюкоза. Замена глюкозы в среде на лактозу приводит к индуцированному или адаптированному (после небольшого периода лагфазы) синтезу фермента галактозидазы (программированному лактозным геном, см. Синтез белка), расщепляющей лактозу на глюкозу и галактозу. В животных тканях подобный быстрый синтез ферментов наблюдается сравнительно реже, и механизм, индуцирующий синтез, изучен только для небольшого числа ферментов (тирозинтрансаминазы, серин- и треониндегидратазы, триптофанпирролазы и др.). Однако при поступлении в организм некоторых ядов, канцерогенных веществ, алкалоидов, инсектицидов и др. наблюдается резкое увеличение через несколько дней активности (соответственно количества) ферментов - гидроксилаз гладкого эндоплазматического ретикулума клеток печени; окисляющих чужеродные вещества в нетоксичные для организма продукты. С другой стороны, описаны случаи, когда под действием подобных гидроксилаз чужеродные вещества превращаются в организме в более токсичные соединения. Это явление, обратное детоксикации, получило название летального синтеза.

Проферменты. Протеолитические ферменты желудочно-кишечного тракта и поджелудочной железы синтезируются в неактивной форме, в виде проферментов (зимогенов). Регуляция в этих случаях сводится к превращению проферментов в активные ферменты под влиянием специфических агентов. Так, трипсин синтезируется в поджелудочной железе в форме трипсиногена. Последний превращается в активный трипсин в кишечнике под действием другого белкового фермента - энтерокиназы, впервые открытого в лаборатории И. П. Павлова. Установлено, что активирующее действие энтерокиназы сводится к отщеплению от трипсиногена гексапептида, приводящему к формированию нативной третичной структуры трипсина и его активного центра (см. выше); наблюдается также аутокатализ. Превращение неактивного пепсиногена в активный пепсин осуществляется аутокаталитически в результате ограниченного протеолиза в присутствии НС1 и также связано с отщеплением от первого специфического ингибитора полипептидной природы (см. Обмен простых белков). Синтез протеиназ в неактивной форме и ряда других неактивных белков-предшественников имеет, очевидно, определенный биологический смысл, предотвращая разрушение клеток органов, в которых образуются проферменты.

Химическая модификация фермента. Выше было указано (см. Химия белков), что ряд белков при формировании третичной структуры подвергается постсинтетической модификации. Оказалось, что ключевые ферменты энергетического обмена - фосфорилаза, гликогенсинтетаза и др. - также контролируются путем фосфорилирования и дефосфорилирования, осуществляемого специфическими ферментами - протеинкиназой и протеинфосфатазой, уровень активности которых в свою очередь регулируется гормонами (см. Обмен углеводов). Уровень активности ключевых ферментов и соответственно интенсивность процессов обмена будут определяться соотношением фосфорилированных и дефосфорилированных форм этих ферментов.

Регуляция активности ферментов по принципу обратной связи. Во многих строго биосинтетических реакциях основным типом регуляции скорости многоступенчатого ферментативного процесса является ингибирование по принципу обратной связи, когда конечный продукт биосинтетической цепи подавляет активность фермента, катализирующего первую стадию.

Предположим, что в клетках осуществляется многоступенчатый биосинтетический процесс, каждая стадия которого катализируется собственным ферментом:

Скорость подобной суммарной последовательности реакций в значительной степени определяется концентрацией конечного продукта (Р), накопление которого выше допустимого уровня оказывает мощное ингибирующее действие на первую стадию процесса, соответственно на фермент E 1 .

Впервые существование подобного механизма контроля активности ферментов метаболитами было показано у Е. coli при исследовании синтеза изолейцина и цитидинтрифосфата (ЦТФ). Оказалось, что изолейцин, являющийся конечным продуктом, избирательно подавляет активность треониндегидратазы, катализирующей первое звено процесса превращения треонина в изолейцин, насчитывающего пять ферментативных реакций. Аналогично ЦТФ как конечный продукт биосинтетического пути оказывает ингибирующий эффект на первый фермент (аспартаттранскарбамоилазу), регулируя тем самым свой собственный синтез. Этот тип ингибирования получил название ингибирования по принципу обратной связи или ретроингибирования. Существование его доказано во всех живых организмах, и в настоящее время он рассматривается как один из ведущих типов регуляции активности ферментов и клеточного метаболиза в целом 1 . (1 Следует указать, что скорость реакции (как и активность ферментов) в чисто биодеградативных (катаболических) процессах регулируется промежуточными продуктами, являющимися индикаторами энергетического состояния клетки (пуриновые нуклеотиды, пирофосфат, неорганический фосфат и др.). )

С другой стороны, в амфиболических процессах (см. Введение в обмен веществ и энергии), выполняющих одновременно биосинтетические и биодеградативные функции 2 , доказано существование регуляции как по типу ретроингибирования, так и макроэргами - индикаторами энергетического состояния клетки. (2 К амфиболическйм процессам относят такие пути, как гликолиз, гликогенолиз, цикл трикарбоновых кислот, гексозомонофосфатный путь, трансаминирование аминокислот (см. Обмен веществ) ). Для амфиболических процессов уникальным типом регуляции, свойственным только им, является, кроме того, активация предшественником, когда первый метаболит в многоступенчатом пути активирует фермент, катализирующий последнюю стадию. Так, доказано активирующее влияние глюкозо-6-фосфата, являющегося предшественником гликогена, на фермент гликогенсинтетазу.

Подобные типы ингибирования конечным продуктом и активирования первым продуктом свойственны аллостерическим (регуляторным) ферментам (см. выше), когда эффектор, структурно отличаясь от субстрата, связывается в особом (аллостерическом) центре молекулы фермента, пространственно удаленном от активного центра. Поэтому принято различать аллостерический тип регуляции, включающий как аллостерическое ингибирование, так и аллостерическую активацию. Взаимопревращения активного и неактивного аллостерического фермента в упрощенной форме, а также конформационные изменения, наблюдаемые при присоединении субстрата и эффекторов, представлены на рис. 59.

Видно, что присоединение отрицательного эффектора к аллостерическому центру вызывает значительные изменения конфигурации активного центра молекулы фермента и как результат потерю сродства фермента к своему субстрату (образование неактивного комплекса).

Аллостерические взаимодействия проявляются в характере кривых зависимости начальной скорости реакции от концентрации субстрата или эффектора, в частности в S-образности кривых (отклонение от гиперболической кривой Михаэлиса - Ментен). Это означает, что связывание одной молекулы субстрата облегчает связывание второй молекулы у аллостерического центра, способствуя тем самым повышению скорости реакции. Кроме того, для регуляторных (аллостерических) ферментов характерна нелинейная зависимость скорости реакции от концентрации фермента.

Другие типы регуляции активности ферментов. Существует ряд других механизмов, контролирующих скорость метаболических процессов и активность внутриклеточных ферментов. К подобным механизмам могут быть отнесены конкуренция ферментов за общий субстрат, выключение активности одного из нзоферментов (у множественных форм ферментов), влияние концентраций кофакторов и их формы (в особенности ионов металлов) и явление компартментализации. Механизм компартментализации играет, по-видимому, важную биологическую роль, пространственно разъединяя посредством биомембран ферменты от своих субстратов (например, лизосомальные ферменты: протеиназы, фосфатазы, рибонуклеазы и другие гидролитические ферменты, от веществ, на которые они действуют в цитоплазме) или взаимно несовместимые в одно и то же время метаболические процессы. Примером последних могут быть пути синтеза жирных кислот, протекающие в основном в растворимой фракции цитоплазмы, и пути распада жирных кислот, сосредоточенные в митохондриях.

Определение активности ферментов

Определение количественного содержания ферментов в биологических объектах представляет известные трудности, поскольку, за редким исключением, ферменты в тканях присутствуют в ничтожно малых концентрациях. Поэтому о количестве ферментов судят по скорости катализируемой реакции, в определенных согласованных условиях измерения. При оптимальных условиях температуры, pH среды и полном насыщении фермента субстратом скорость пропорциональна концентрации фермента. О скорости ферментативной реакции судят или по скорости убыли субстрата, или по скорости образования продукта реакции.

Для выражения концентрации фермента Комиссией по ферментам Международного биохимического союза рекомендована стандартная единица (Е). За единицу любого фермента принимается то количество его, которое в оптимальных условиях катализирует превращение 1 мкмоль субстрата в минуту (мкмоль/мин). Предложено новое определение международной единицы фермента катал (кат, kat), соответствующее количеству фермента, способному вызывать превращение 1 моль субстрата в продукт в 1 с (1 моль/с). Отношение международной единицы (Е) к каталу можно выразить следующим образом:

или 1 Е=1 мкмоль · мин -1 = (1/60) мкмоль · с -1 = (1/60) мккат = 16,67 нкат. Таким образом, 1Е фермента соответствует 16,67 нкат.

Рекомендовано, кроме того, проведение измерения единиц фермента при 25°С, оптимуме pH и концентрации субстрата, превышающей концентрацию насыщения. В этих случаях скорость соответствует нулевому порядку реакции в отношении субстрата и будет зависеть только от концентрации фермента.

Для выражения активности фермента пользуются определением удельной и молекулярной активности. Удельную активность фермента принято выражать числом единиц ферментативной активности на 1 мг белка (или числом каталов на 1 кг активного белка). Число молекул субстрата, подвергающихся превращению одной молекулой фермента в минуту, принято называть числом оборотов, или молекулярной активностью. Так, одна молекула каталазы эритроцитов способна расщепить в 1 мин 5 · 10 6 молекул перекиси водорода 1 . (1 Для того чтобы 1 атом неорганического железа, также катализирующий распад Н 2 O 2 , расщеплял такое число молекул Н 2 O 2 , которое расщепляет каталаза в 1 с, потребовалось бы более 300 лет. Этот пример является наглядным доказательством одного из главных свойств ферментов - их высокой каталитической активности. )

Преподаватель:
к.б.н
Кузнецова Екатерина Игоревна

Механизмы инактивации ферментов
1. Изменение первичной структуры:
1.1. Разрыв полипептидной цепи:
Жесткие условия (длительное кипячение в HCl) –
гидролиз до отдельных ам-т.
При нагревании до 100 °С (pH 7-8), гидролиз
пептидных связей незначителен.
Наиболее чувствительными к
высокотемпературному гидролизу являются
пептидные связи, образованные остатками
аспарагиновой кислоты.
Протеазы (бактериальное загрязнение, автолиз).

Решение:


инактивированных ферментов.

1.2.Окисление функциональных групп фермента
SH-группы цистеина и индольные фрагменты
триптофана, при повышенной температуре, могут
окисляться (сульфокси- соединения цистеина
(SOH, SO2H) и образовываться продукты
раскрытия индольного кольца триптофана.

Решение:
Реактивировать с помощью восстанавливающих
агентов, в частности низкомолекулярных тиолов
(например, цистеин или дитиотрейтол) .

Вызывают: Тиолы и другие восстановленные
соединений серы, например Na2SO3, Na2S2O3.
Продуктом восстановления дисульфидной связи
(S-S) является:
1) тиольная форма (белок–SH)
2) смешанный дисульфид тиольной формы белка с
восстанавливающим реагентом, например
белок–S–SO3).

1.3. Расщепление дисульфидных связей
Щелочной гидролиз цистеина →дегидроаланин→
Благодаря нуклеофильным свойствам
взаимодействует с NH2-группами лизина и SHцистеина →лизиноаланин и лантионин.
Для полной деструкции всех S–S связей требуются достаточно жесткие условия (0,1–1М щелочь,
100 °С).
Однако деструкция наиболее реакционноспособных
S–S связей может проходить в достаточно мягких
условиях – например, при температурах 60–80 °С и
слабощелочных значениях рН.
Cледует учитывать при использовании ферментов в
качестве добавок к моющим средствам.

Решение:
Добавление в среду тиолов приведет к
расщеплению смешанного дисульфида и
последующему образованию правильной S–S связи

1.4. Химическая модификация каталитических SHгрупп.
Катионы тяжелых металлов (Hg, Pb и Cu)
связываются с SH-групп активного центра
фермента
↓
Образование соответствующих меркаптидов
↓
Фермент инактивируется

10.

1.5. Фосфорилирование белков in vivo.
Под действием фосфорилазы и фосфатазы,
содержащихся в полуочищенных ферментативных
препаратах в виде примесей
↓
Фосфорная кислота связывается с ОН-группами
серина и треонина.
↓
Конформационные изменения в белковой
молекуле
↓
инактивацию фермента.

11.

Решение:
В литературе практически отсутствуют примеры
удачной реактивации подобным образом
инактивированных ферментов.

12.

1.6. Дезаминирование остатков аспарагина.
При температурах (порядка 100 °С) и рН (порядка
4,0–5,0) происходит дезаминирование остатков
аспарагина.
↓
инактивации фермента.

13.

Решение:
В литературе практически отсутствуют примеры
удачной реактивации подобным образом
инактивированных ферментов.

14.

1.7. Радиационная инактивация ферментов
γ-облучение и УФ-свет
Воздействуют на функциональные группы
ферментов, пептидные связи и SH-группы
остатков цистеина.

15.

2. Агрегация
Наблюдается при повышенной температуре, при
экстремальных значениях рН, в присутствии
некоторых химических соединений.
Чем выше концентрация, тем быстрее идет
агрегация.
Гидрофобные взаимодействия и водородные
связи, возможно образование дисульфидных
мостиков между отдельными белковыми
молекулами

16.

Решение:
Необходимо разрушить межмолекулярные
ковалентные и нековалентные контакты c
помощью концентрированных растворов
мочевины и гуанидинхлорида, экстремальных
значений рН.
Если при агрегации ферментов образовались
межмолекулярные S-S -мостики, в среду вносят в
относительно невысоких концентрациях
(мкмоль/л) тиолсодержащие реагенты (например,
цистеин или дитиотрейтол).
При таких концентрациях внутримолекулярные
S–S связи в белке, как правило, не затрагиваются.

17.

3. Инактивация ферментов поверхностным
натяжением
Поверхностное натяжение на границе раздела
между воздухом и чистой водой составляет 80
дин/см.
Пенообразование вызывает денатурацию
ферментов, адсорбированных на границе раздела
фаз.

18.

Решение:
Добавление ПАВ снижает поверхностное
натяжение до 1 дин/см.

19.

4. Сорбция белка на стенках реакционного
сосуда
Сорбция за счет нековалентных взаимодействий
приводит к уменьшению концентрации фермента в
растворе.
Необходимо учитывать при работе с
разбавленными белковыми растворами
(концентрация 10-8–10-10 моль/л).
Под влиянием денатурирующих факторов
способность белков сорбироваться на стенках
реакционного сосуда может возрастать.

20.

Решение:
Десорбция фермента со стенок реакционного
сосуда достигается за счет разрушения
неспецифических взаимодействий между
белком и сорбционными центрами на поверхности
сосуда.
Можно использовать экстремальные значения рН,
концентрированные растворы мочевины или
гуанидинхлорида.

21.

5. Диссоциация олигомерных белков на
субъединицы
Вызывают: Мочевина, детергенты, кислоты или же
нагревание.
Приводят к:
конформационным изменениям отдельных
субъединиц;
агрегации субъединиц;
диссоциации кофакторов из активных центров;
модификации функциональных групп, которые в
олигомерном белке были экранированы от
контакта с растворителем.

22.

6. Десорбция кофактора из активного центра
фермента
Вызывает: нагревание, действие хелаторов, диализ
Если диссоциация кофактора сопровождается
значительными конформационными сдвигами или
химической модификацией важных
функциональных групп → фермент
инактивируется необратимо.
Если при этом не произошло существенного
изменения белковой конформации, то добавление
в среду избытка кофактора приводит к
реактивации фермента.

23.

Регенерация кофакторов
Способы регенерации:
Ферментативный (методы с использованием сопряженных субстратов или ферментов)
Неферментативный (химические и
электрохимические подходы)

24.

Ферментативный способ

В систему вводят избыточное количество
сопряженного субстрата того же фермента:
Пример: при работе алкогольдегидрогеназы
расходуется НАДН.

25.

Ферментативный способ
1. Использование сопряженных субстратов.
Недостатка:
используются высокие концентрации
сопряженного субстрата, так как равновесие
реакции сильно сдвинуто в сторону
образования спирта;
усложняет процедуру выделения основного
продукта из реакционной смеси.

26.

Ферментативный способ
2. Использование сопряженных
ферментативных реакций
В систему, дополнительно вводят фермент 2,
функционирование которого обеспечивает
регенерацию кофермента.
Используемые в системе ферменты должны иметь
разную субстратную специфичность

27.

Неферментативные способы
1. Химические методы.
Используются дитионит натрия и некоторые
соли пиридиния:
+ Низкая стоимость.
- могут ингибировать отдельные ферменты.
Флавиновые коферменты

28.

Неферментативные способы
2. Электрохимические методы.
Прямое электрохимическое восстановление или
окисление.
“-” появления в процессе регенерации
ферментативно неактивных форм кофермента,
например в результате его димеризации.

29. СТАБИЛИЗАЦИЯ ФЕРМЕНТОВ В БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ СИСТЕМАХ

30.

Проблемы возникающие при использовании
ферментов в биотехнологических процессах:
1. Повышенные температуры
2. Экстремальные значения pH
3. Высокие концентрации органических
растворителей или ПАВ.
4. Невозможность многократно использовать
фермент.
5. Сложность при разделении фермента от
продукта.

31.

Основные подходы для стабилизации
ферментов:
1. Добавление стабилизирующих веществ в среду,
в которой хранится фермент или проводится
ферментативная реакция.
2. Химическая модификация фермента.
3. Иммобилизация фермента.

32.

1. Субстратов или их аналогов:
Фермент-субстратный комплекс часто более
устойчив, чем свободный фермент.
Пример: Лактатдегидрогеназа в присутствии
лактата более термоустойчив.

33.

Стабилизация ферментов с помощью:
2. Органических растворителей:
Многоатомные спирты стабилизируют некоторые
ферменты за счет повышения устойчивости
внутримолекулярных водородных связей белка.
Пример: Химотрипсин в присутствии 50–90 %
глицерина более устойчив к протеолизу

34.

Стабилизация ферментов с помощью:
3. Солей:
При низких концентрациях солей (<0,1M) катионы
Са2+, Zn2+, Mn2+,Fe2+ и др. могут специфично
взаимодействовать с металлопротеинами.
Некоторые из них - кофакторы.
Са2+ способен стабилизировать третичную
структуру ряда белков благодаря образованию
ионных связей с двумя различными
аминокислотными остатками.
Пример: у α-Амилазы (из bacillus caldolyticus)
Са2+ значительно повышает термическую
устойчивость.

35.

36.

Химическая модификация фермента
1. Фермент принимает более стабильную
конформацию.
2. Введение в белок новых функциональных групп
приводит к образованию дополнительных
стабилизирующих водородных связей или солевых
мостиков.
3. При использовании неполярных соединений
усиливаются гидрофобные взаимодействия.
4. Модификация гидрофобных областей поверхности
белка гидрофильными соединениями уменьшает
площадь неблагоприятного контакта внешних
неполярных остатков с водой.
Пример: глутаровый альдегид

37.

Иммобилизация фермента позволяет:
Повысить устойчивость фермента (нагреванию,
автолизу, действию агрессивных сред и т. д)
1. Многократно использовать фермент
2. Отделять фермент от реагентов и продуктов
реакции.
3. Прерывать реакцию в нужный момент.

38.

Иммобилизованные ферменты – это препараты
ферментов, молекулы которых связаны с
носителем, сохраняя при этом полностью или
частично свои каталитические свойства.
Методы иммобилизации:
1. Химические
2. Физические

39.

Методы иммобилизации:
В качестве носителей могут применяться:
1)Органические материалы:
1.1) природные (полисахариды, белки, липиды)
1.2) синтетические полимерные носители
2) Неорганические материалы (матрицы на
основе силикагеля, глины, керамики, природных
минералов и т. д.)

40.

1) адсорбция фермента на нерастворимом носителе
в результате электростатических, гидрофобных,
вандер-ваальсовых и др. взаимодействий;

;

структуры;
4) Включение в двухфазную систему.

41.

Методы физической иммобилизации:

Достигается путем контакта водного раствора
фермента с носителем.

42.

Методы физической иммобилизации:
1)адсорбция фермента на нерастворимом носителе
Факторы влияющие на адсорбцию:
1. Удельная поверхность и пористость носителя
2. Значение рН (на не ионообменниках мах адсорбция
в изоэлектрической точке белка)
3. Ионная сила раствора (возрастание ионной силы –
десорбция фермента, но иногда обратная ситуация
“высаливание”)
4. Концентрация фермента.
5. Температура (с одной стороны денатурация, с
другой ускоренная диффузия)

43.

Методы физической иммобилизации:
1)адсорбция фермента на нерастворимом носителе
Преимущества:

2) Доступность носителей
Недостатки:
1) Недостаточная прочность связывания
2) Многие носители биодеградируемы

44.

Методы физической иммобилизации:
2) включение фермента в полупроницаемую
капсулу, в полупроницаемую мембрану

45.

Методы физической иммобилизации:
2) включение фермента в полупроницаемую
капсулу, в полупроницаемую мембрану
Преимущества:
1) Относительная простота методики
2) Защита от микроорганизмов
3) Нет диффузионных ограничений (т.к.
отношение поверхности к площади велико и
толщина мембраны невелика)
Недостатки:
1) Биодеградируемы
2) Не применим для высокомолекулярных

46.

Методы физической иммобилизации:
3) механическое включение фермента в гелевые
структуры
Фермент включается в трехмерную сетку
полимерных цепей, образующих гель.

47.

Методы физической иммобилизации:
3) механическое включение фермента в гелевые
структуры
Необходимо учитывать:
1. Соответствие размера пор размеру фермента.
2. Природа матрицы (т.к. она создает
микроокружение для фермента, может
создавать рН отличное от рН раствора и
повышать сродство субстрата к матрице, что
повышает скорость ферментативной реакции)

48.

Методы физической иммобилизации:
3) механическое включение фермента в гелевые
структуры
Преимущества:
1) Относительная простота методики
2) Повышенная механическая, химическая и
тепловая стойкость матриц.
3) Происходит стабилизация фермента
4) Фермент защищен от бактериального
повреждения
Недостатки:
1) Не применим для высокомолекулярных

49.

Методы физической иммобилизации:
4) Включение в двухфазную систему
Фермент растворим только в одной из фаз, а
продукт - в другой
Позволяет работать в высокомолекулярными
субстратами.

50.

Методы химической иммобилизации:
Образовании ковалентных связей между
ферментом и носителем.
Преимущества:
1) Высокая прочность конъюгата
2) Можно повышать стабильность фермента

51.

При иммобилизации ферментов необходимо
соблюдать следующие условия:
1. Активные группы матрицы не должны
блокировать каталитический центр фермента.
2. Иммобилизации не должны приводить к потере
активности фермента.

52.

Весьма перспективным является использование в
качестве биокатализаторов иммобилизованных
клеток.
Т.к. можно избежать:
1) дорогостоящие стадии выделения и очистки
ферментов
2) необходимости их последующей стабилизации

53.

Термозимы
Стабильны в условиях высокой температуры,
высоких концентраций солей и экстремальных
значений рН.
Гипертермофильные микроорганизмы,
встречающиеся среди Archaea и Bacteria, живут
при температурах 80–100 °С.

54.

Механизмы ответственны за термоустойчивость
ферментов у термозимов:
Между мезофильными и термофильными
версиями ферментов - высокая степень гомологии
последовательности и структуры.
Так, последовательности термостабильных
дегидрогеназ из Pyrococcus и Thermotoga на 35 и
55% соответственно идентичны
последовательности мезофильной дегидрогеназы
из Clostridium.

55.

Было обнаружено, что дегидрогеназа из Pyrococcus
furiosus (Tm == 105 °C) содержит 35 изолейцинов,
в то время как дегидрогеназы из Thermotoga
maritima (Tm = 95 °C) и Clostridium symbiosum (Tm
= 55 °C) только 21 и 20 изолейцинов
соответственно.
Термостабильные ферменты содержат меньше
глицина: Cs дегидрогеназа содержит 48 остатков
глицина, а дегидрогеназы из Tm и Pf только
39 и 34 глицина соответственно.
Больше изолейцина и меньше глицина.

56.

Возросшая термостабильность коррелирует:
1) с увеличением жесткости белковой структуры
за счет уменьшения содержания остатков
глицина,
2) с улучшением гидрофобных контактов в ядре
дегидрогеназы из Pf в результате замены валина
изолейцином. (В результате сайт-направленного
мутагенеза приводящего к замене изолейцина
на валин термостабильность мутантов
уменьшалась).

57.

Механизмы стабилизации:
минимизация доступной площади гидрофобной
поверхности белка;
оптимизация упаковки атомов белковой
молекулы (минимизация отношения
поверхность/объем);
оптимизация распределения зарядов (достигается
благодаря устранению отталкивающих
взаимодействий, а также в результате организации
взаимодействий между зарядами в своеобразную
сеть)
Уменьшение количества впадин

58.

Применение ферментов из экстремофилов
Современные технологии молекулярной биологии
и генной инженерии позволяет:
1) получать достаточные количества ферментов из
экстремофилов для их последующего
анализа и практического применения.
2)клонирование и экспрессия этих ферментов в
мезофильных организмах.

59.

Крахмал используется для производства сахаров.
Сначала процесс ведется при (95–105 °С) и при значениях
рН 6–6,5.
На следующем этапе температура снижается до 60°С и
рН=4,5.
Использование термостабильных ферментов (αамилазы, глюкоамилазы, ксилозоизомеразы),
выделенных из гипертермофилов, позволит:
1) проводить процесс в одну стадию и при одних и
тех же условиях
2) отказаться от дорогостоящих ионообменников

60.

Применение ферментов из экстремофилов:
Наиболее термостабильные α-амилазы были
обнаружены у archaea Pyrococcus woesei,
Pyrococcus furiosus, Desulfurococcus mucosus,
Pyrodictium abyssi и Staphylothermus
marinus. Гены амилазы из Pyrococcus sp. были
клонированы и экспрессированы в E.coli и Bacillus
subtilis.

61.

Применение ферментов из экстремофилов:
Протеолитические ферменты
Сериновые щелочные протеиназы широко
используются в качестве добавок к моющим
средствам.
Протеиназы из экстремофилов сохраняют
нативность при высоких температурах, в
присутствии высоких концентраций детергентов и
других денатурирующих агентов. Pyrococcus,
Thermococcus, Staphylothermus, Desulfurococcus и
Sulfolobus. Максимальную активность эти
ферменты проявляют при температурах
от 90 до 110 °С и значениях рН от 2 до 10

62.

Применение ферментов из экстремофилов:
ДНК-полимеразы
Термостабильные ДНК-полимеразы используются
в ПЦР и играют важную роль в генной инженерии.
Термостабильные полимеразы были обнаружены у
гипертермофилов Pyrococcus furiosus и Pyrococcus
litoralis, а также у термофилов Thermus aquaticus.

C точки зрения эффективности применения биокатализаторов было бы крайне заманчиво не только повысить стабильность ферментов, но и научиться возвращать активность отработанным в ходе технологического процесса ферментативным препаратам.

Практически одновременно с обнаружением феномена инактивации ферментов (начало ХХ в.) исследователи стали предпринимать попытки их реактивации. К настоящему времени накоплено довольно много положительных примеров в этом направлении. Их удобно классифицировать согласно причинам, вызывающим инактивацию.

Реактивация агрегированных белков . Ее часто удается осуществить, разрушив межмолекулярные нековалентные контакты (гидрофобные, электростатические, водородные связи). Для этого используют те же денатуранты, которые разрушают нековалентные взаимодействия в нативных белках, вызывая их обратимую денатурацию: концентрированные растворы мочевины и гуанидин хлорида‚ экстремальные значения рН и т. п.

Реактивация белков с измененной первичной структурой . Если белок потерял активность в результате химической модификации функциональных групп, то можно попытаться реактивировать его с помощью обратной химической реакции. Ферменты, инактивированные путем модификации SH-групп (например, их окислением), иногда удается реактивировать, добавляя избыток низкомолекулярного тиола или другого восстановителя.

Десорбция инактивированного белка со стенок сосуда . «Сорбционная инактивация» белков обусловлена слабыми нековалентными взаимодействиями (электрическими, гидрофобными, водородными связями) между белком и поверхностью реакционной ячейки. Реактивация в этом случае достигается за счет разрушения неспецифических взаимодействий при экстремальных значениях pH, под действием концентрированных растворов мочевины или гуанидин хлорида и других реагентов, являющихся «обратимыми денатурантами» для большинства белков.

Реактивация «необратимо денатурированного» белка . Реактивацию удается провести, руководствуясь следующей двухстадийной схемой: сначала в инактивированном белке следует разрушить все, в том числе ненативные нековалентные взаимодействия, т. е. перевести белок в развернутое состояние и уже из этого состояния попытаться свернуть его в нативную конформацию. Таким образом, в общем случае задача о реактивации какого-либо «необратимо денатурированного» фермента, по существу, свалится к решению двух задач. Во-первых, поиску условий, при которых инактивированный белок удается развернуть. Для разворачивания инактивированных белков обычно используют те же реагенты, с помощью которых нативные (неинактивированные) белки можно перевести в состояние статистического клубка. Это концентрированные растворы обратимых денатурантов (мочевины или гуанидин хлорида). Во-вторых, экспериментальному подбору условий, в которых развернутый белок успешно сворачивается в нативную (каталитически активную) конформацию. Для этой цели часто полезными оказываются эффекторы ферментативной активности (субстраты, ингибиторы, кофакторы и т. п.)‚ которые одновременно являются и эффекторами сворачивания, т. е. повышают выход реактивации фермента.

Регенерация кофакторов (коферментов)

К категории кофакторов относятся коферменты, простетические группы и ионы металлов. С технологической точки зрения наибольший интерес представляет регенерация коферментов. Коферменты - это низкомолекулярные органические соединения, которые играют роль дополнительного субстрата в функционировании многих ферментов.

При использовании систем иммобилизованных ферментов с коферментами приходится решать две задачи: собственно регенерацию кофермента и его удержание в реакционной системе. Последнее обычно осуществляется путем ковалентной иммобилизации коферментов на полимерных носителях. Для регенерации разработано несколько подходов‚ суть которых отражается следующей схемой:

Согласно этой схеме кофермент, изменяющийся в реакции с участием одного из ферментов, благодаря системе сопряженных реакции регенерирует, т.е. принимает свое первоначальное состояние. В зависимости от типа сопряженной реакции все способы регенерации коферментов можно разделить на две группы: ферментативные и неферментативные. К ферментативным относятся способы регенерации с использованием сопряженных субстратов или сопряженных ферментов. Неферментативные пути можно подразделить на химические и электрохимические.

Система регенерации ATP – это непрерывный процесс превращения АДФ в АТФ, катализаторами в котором выступают ферменты, фосфорилирующие дифосфат, используя в качестве доноров фосфата фосфатсодержащие соединения (ацетилфосфат, креатинфосфат, аргининфосфат и т.д.).